作者：夏晓莉作者本人请参看权力声明
导师姓名：刘秀梵
学位授予单位：扬州大学
授予学位：硕士
学位年度：
专业：预防兽医学
关键词：鸡喉气管炎病毒重组鸡痘病毒免疫效力免疫荧光试验
鸡沾染性喉气管炎（ILT）是由鸡沾染性喉气管炎病毒（ILTV）惹起的鸡的急性上呼吸道沾染病。该病散布于世界各地，可惹起鸡的逝世亡和产蛋降低而形成严重的经济丧失，被国际兽医局（OIE）列为B类疾病。今朝国际外防制本病广泛采取弱毒疫苗。该疫苗固然具有较好的免疫后果，但一切的弱毒疫苗都存在：毒力广泛偏强，接种后反响年夜；也能惹起埋伏沾染，使鸡毕生带毒；可以由接种鸡沾染给非接种鸡，在流传进程中毒力会返强等缺陷。国际虽已有贸易化的表达ILTV糖卵白gB的重组鸡痘病毒，但免疫后果受FPV母源抗体的搅扰。是以，急需研讨更平安、有用的疫苗用于防制和祛除ILT。本试验室后期研讨注解，外源基因拔出分歧复制非必须区影响重组鸡痘病毒抵御母源抗体搅扰的才能，个中应用本室构建的转移载体p12LS取得的rFPVs都表示出较年夜的抗母源抗体搅扰优势。糖卵白gB是ILTV的kDa糖卵白复合物，能引诱机体发生高程度的体液免疫和细胞免疫，是ILTV的重要掩护性抗原和沾染所必须卵白，与病毒吸赞同穿入细胞有关。本研讨依据已揭橥的ILTV中国王岗株的gB基因序列，设计了一对特异性引物，经由过程PCR办法扩增了ILTV中国王岗株的gB基因，并将之克隆入pGEM一Teasy载体落后行测序，获得了阳性质粒pTgB。将pTgB中的ILTV糖卵白gB基因再亚克隆至鸡痘病毒（FPV）转移载体p12LS中，获得了p12LSgB。将p12LSgB转染被亲本鸡痘病毒LP沾染的CEF。经蓝斑挑选、纯化后取得的同源重组病毒rFPV一ILTVgB经由过程PCR办法判定，证实其基因组中含有ILTV糖卵白gB基因，直接免疫荧光实验（IFA）也证实该重组病毒在其沾染的CEF中表达了ILTV糖卵白gB。用该重组病毒rFPV一ILTVgB、商品化的ILTV弱毒苗及FPVLP株分组免疫35日龄的SPF鸡（每组10只鸡，分组隔离豢养）。并设非免疫对比组（5只鸡）。个中rFPV一ILTVgB和FPVLP株以PFU/只的剂量、ILTV弱毒苗以1羽份/只的剂量停止免疫接种。免疫后21天用ILTV中国王岗株以0。4mL剂量喉内接种攻毒，经由过程检测免疫后ILTV抗体程度、攻毒后病发率与逝世亡率等目标评价疫苗的免疫掩护效率，比拟重组鸡痘疫苗与惯例弱毒苗之间的免疫效率差别。从攻毒后的免疫掩护情形看，重组鸡痘病毒（50％的病发率和0％的逝世亡率）比非免疫对比组（％病发率和60％逝世亡率）和FPVLP免疫组（％的病发率和10％逝世亡率）好，但比弱毒免疫组（30％的病发率和0％的逝世亡率）差一些。这能够与重组疫苗仅表达gB基因，抗原绝对单一，糖卵白gB表达量没有ILTV本身表达量高有关。综上所述，本试验构建的表达ILTV糖卵白gB的重组鸡痘病毒rFPV一ILTVgB，能在必定水平上掩护SPF鸡抵御强毒的进击。
为了检测表达鸡传染性喉气管炎病毒糖蛋白gB基因的重组鸡痘病毒(rFPV-ILTVgB)的稳定性,我们对重组病毒第6代和16代进行克隆纯化,对纯化后的病毒通过转瓶连续培养传代20代.结果发现第6代纯化病毒(rFPV-ILTVgB-C6)在传代过程中有白斑出现,说明病毒纯度不够;经过16代纯化的病毒(rFPV-ILTVgB-C16)对细胞的嗜性加强,病毒的效价进一步升高,20代传代后蓝斑率仍然为﹪,PCR的检测进一步证明插入的外源基因能在病毒的长期传代过程中稳定地遗传.抽取病毒细胞传代过程中的5,10,15,20代次的病毒翅膀内侧无血管处皮下接种2周龄SPF鸡,20天后分为两组,分别用传染性喉气管炎病毒WG株和鸡痘病毒株攻击,结果不同代次的重组病毒均可以使免疫鸡抗传染性喉气管炎病毒和鸡痘病毒强毒的攻击.鸡体内病毒传代试验表明,重组病毒在接种部位仅存在6天,之后就检测不到病毒,重组病毒通过SPF鸡连续传代,不存在病毒返祖的可能.由此可以得出一个结论,rFPV-ILTVg在结构上和免疫原性上是稳定的,无论是在体外传代,还是在体内均可以稳定遗传,不存在因为接种重组疫苗而给免疫鸡群带来安全威胁的可能,完全可以作为疫苗毒株进行商品化开发.
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