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黄牛阿氏肠杆菌的分离鉴定及生物学特性

阿氏肠杆菌属于革兰阴性菌,生活在水和土壤中,为条件性致病菌。阿氏肠杆菌可从人类多种样本来源中分离到,其中最常见的是尿液、呼吸道、粪便、伤口和血液,其中有50%是从60岁及以上的人群中分离得到。方福明等曾从水牛中分离到一株阿氏肠杆菌,该报道称云南某村庄连续发生水牛疫情,各年龄段的水牛均可感染发病,这是国内首次关于阿氏肠杆菌感染家畜的病例。由此可见,阿氏肠杆菌既能感染人类,也能感染家畜,对人类的健康和畜牧业的发展都存在潜在的威胁,且具有极强的传染性和致病性。

都安县某牛场从山东引进架子牛60头,引进1周后,牛开始出现咳嗽,逐渐死亡,病程约一个月,共死亡50头。剖开可见肺严重出血。送检的病死牛解剖,肺脏有严重出血,其他脏器无明显肉眼可见的变化。用接种环无菌采取肺脏出血部分,分别在血琼脂平板和麦康凯培养基上接种,置于37℃恒温培养箱中培养。挑取初次培养的单个菌落在麦康凯培养基、血琼脂平板中三区划线,37℃培养24h~48h。在血琼脂平板上24h后生长出灰白色菌落,未见有溶血现象。在麦康凯培养基上37℃培养24h~48h后长出圆形灰色,轻度隆起,光滑湿润,边缘整齐,直径为0.2mm~0.3mm的针尖状小菌落。在普通营养肉汤中生长呈絮状物浑浊。革兰染色镜检,光学显微镜下可观察到散在分布的短杆状革兰阴性菌。

生化试验结果显示,该菌的甲基红试验为阳性,能利用柠檬酸盐,MR试验阳性,VP试验阴性,能利用鸟氨酸脱羧酶,吲哚反应为阴性,不产H2S,发酵d-葡萄糖、乳糖、蔗糖、山梨醇、阿拉伯糖,不发酵茉莉酮糖,不利用苯丙氨酸,不利用脂肪酶和DNA酶。符合Edwards等对阿氏肠杆菌的鉴定结果。

用16SrRNA通用引物扩增出预期片段bp,测序结果在NCBI上进行基因序列比对,鉴定结果与阿氏肠杆菌的同源性为99%,可以证实该菌为阿氏肠杆菌。将分离株命名为GX.1,用DNAStar软件对测序结果进行同源性分析,可以看出GX.1与NCBI上已登录的阿氏肠杆菌MH、MH、MH、MH、MH、MH、MH在一个大的分支上,同源性为99%。

阿氏肠杆菌分离株16SrRNA序列进化树

小鼠腹腔注射分离菌的肉汤培养物后,24h内全部死亡,剖检可见明显的败血症病理变化;对照小鼠注射无菌生理盐水均正常存活。对剖检呈败血症的小鼠采集病料,进行细菌分离,PCR,送检测序,并在NCBI上进行基因序列比对,证实是原病原菌引起小鼠的死亡。

从体外药敏试验结果来看,该阿氏肠杆菌对青霉素、苯唑西林、氨苄西林、泰乐菌素、林可霉素、磺胺二甲氧嘧啶、利高霉素完全耐药;对庆大霉素、卡那霉素、土霉素、多西环素和恩诺沙星中度耐药;仅对头孢曲松钠、头孢哌酮钠舒巴坦钠和头孢地嗪钠敏感,敏感程度为头孢曲松钠头孢地嗪钠头孢哌酮钠舒巴坦钠。该体外药敏试验结果提示该牛场可能过分依赖和使用抗菌药,导致病原菌存在较为严重的耐药现象。

对送检的病死黄牛进行尸体剖检,发现肺脏有严重出血,对可引起肺脏病变的常见病原,如牛副流感病毒3型、牛病毒性腹泻病毒、牛支原体、牛传染性鼻气管炎病毒、牛流行热病毒、化脓隐秘杆菌、多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌、肺炎克雷伯氏菌进行PCR检测,结果均为阴性。从出血的肺组织中分离到一株细菌,对该分离菌进行染色镜检,光学显微镜下观察该菌为短杆状的革兰阴性菌。培养特性和生化鉴定结果符合阿氏肠杆菌的特性;提取该分离菌的DNA,进行16SrRNA测序,基因序列比对结果显示该菌与阿氏肠杆菌的同源性达到99%,这是国内关于黄牛阿氏肠杆菌病的首次发现。

对该株阿氏肠杆菌进行致病力试验,结果显示该菌有较强的致病性,能致小鼠24h内死亡,剖检可见小鼠有典型的败血症症状。目前国内关于阿氏肠杆菌的报道极少,本试验从黄牛中分离到的阿氏肠杆菌与方福明关于水牛的报道临床症状和发病特点基本相一致,都具有发病急,病程短和死亡率高等特点,都能引起肺部出血性炎症,牛感染该病后具有较强的传染性,传染源为带菌牛及其粪便,传播速度快,可使牛短时间内大量死亡,给农户带来巨大的经济损失。这两次阿氏肠杆菌引起的动物疫病发生于夏季,有季节性,可能与南方潮湿温热的天气环境有关。

体外药敏试验结果显示,此次分离到的阿氏肠杆菌对大部分的抗菌药物已经产生耐药性,仅对头孢类药物敏感,说明该牛场滥用抗菌药,目前对发病的牛可用头孢类药物进行控制,已经病死的牛及时深埋,病牛粪便进行生物热发酵处理,对于还未发病的动物,用头孢类药物进行预防,并对畜舍进行彻底消毒。

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